Het effect van N1-N2 neutrofielen op bot en kraakbeen regeneratie

60-70% van de witte bloedcellen zijn neutrofielen. Ze spelen een cruciale rol
in het aangeboren immuunsysteem. Neutrofielen fungeren als
frontlinieverdedigers tegen PAMPs en DAMPs en migreren naar ontstekingsplaatsen
door vervorming, adhesie, infiltratie en migratie. Verder voeren neutrofielen
essentiële functies uit via verschillende mechanismen, zoals de vorming van
NET's en de productie van cytokinen en granulaire eiwitten.

Fridlender et al. beschreef twee soorten neutrofielen, N1 pro-inflammatoire en
N2 anti-inflammatoire neutrofielen, gelijkend op M1 en M2 macrofaag fenotypes.
De N1/N2 neutrofielen zijn onderzocht in meerdere specialismes. Voortbouwend op
de inzichten van Fridlender et al., ontwikkelde Ohms et al. een protocol om
menselijke neutrofielen in vitro te polariseren in N1- en N2-fenotypes.
Hierdoor werd verdere verkenning van de kenmerken van N1- en N2-neutrofielen
mogelijk gemaakt. In daaropvolgende onderzoeken hebben onderzoekers
vergelijkbare methoden gebruikt om verschillende neutrofiele fenotypes te
identificeren op basis van biomarkers. Subsets van neutrofielen, aangeduid als
N1 (gekarakteriseerd door CD54 en CD95) en N2 (gedefinieerd door CD182), werden
hierbij onderzocht.

Bot- en kraakbeengenezing is een proces waarbij de actieve deelname van
neutrofielen betrokken is. De vele rollen van neutrofielen bij botregeneratie
omvatten diverse mechanismen, zoals de vorming van NET's, angiogenese, invloed
op de extracellulaire matrix en interactie met macrofagen. Echter is er een
gebrek aan onderzoeken die de uiteenlopende effecten van neutrofielen koppelen
aan N1/N2-neutrofielenfenotypes. Cai et al. hebben de rol van N2-neutrofielen
bij de genezing van muizenbotten aangetoond. Het blijft echter onduidelijk of
N1- en N2-neutrofielenfenotypes kunnen worden toegeschreven aan de diverse
rollen die worden waargenomen bij menselijke botregeneratie. Bovendien is de
herkenning van N1- en N2-neutrofielen erg complex op het gebied van
kraakbeenregeneratie.
In deze studie gebruiken we de polarisatie van N1- en N2-neutrofielen om
potentiële differentiële effecten op de osteogene differentiatie van menselijke
mesenchymale stamcellen en de chondrogenese te onderzoeken. Onze hypothese is
dat N1-neutrofielen deze processen remmen, terwijl N2-neutrofielen zowel
osteogenese als chondrogenese bevorderen.

Het doel van deze studie is het onderzoeken van de kenmerkende
oppervlaktebiomarkers en cytokines die worden aangetroffen in het medium van
N1- en N2-neutrofielen. Bovendien heeft deze studie tot doel de verschillende
effecten van N1- en N2-neutrofielen op bot- en kraakbeenregeneratie te
onderzoeken. We veronderstellen dat N1-neutrofielen ontstekingseigenschappen
vertonen (verhoogde niveaus van CD54, CD95, Tumor Necrosis Factor α (TNF-α),
IL-8, Monocyte Chemoattractant Protein 1 (MCP-1)), wat leidt tot de remming van
bot- en kraakbeenregeneratie . Omgekeerd verwachten we dat N2-neutrofielen
ontstekingsremmende eigenschappen vertonen (verhoogde niveaus van CD182,
SDF-1α), waardoor bot- en kraakbeenregeneratie wordt bevorderd.

De studie is opgezet als in vitro studie waarbij vers humaan bloed wordt
gebruikt. Het bloed zal worden afgenomen van gezonde vrijwilligers door middel
van venapunctie.
Neutrofielen zullen in het laboratorium uit het donorbloed worden geïsoleerd en
in vitro worden gestimuleerd met behulp van een gespecialiseerd kweekmedium. Na
stimulatie zullen de neutrofielen waarvan wordt verwacht dat ze de N0-, N1- en
N2-fenotypes vertonen, worden onderzocht met behulp van flowcytometrie en
ELISA. Vervolgens worden deze gebruikt om BMSC's of chondrocyten te stimuleren.
De osteogene en chondrogene capaciteit van respectievelijk BMSCs en
chondrocyten wordt nadien geanalyseerd. Ten laatste zullen de N0-, N1- en
N2-neutrofielen kunstmatig worden gehecht aan objectglaasjes voor MALDI-MSI, om
de unieke metabolieten en hun ruimtelijke verdeling geassocieerd met de N0-,
N1- en N2-fenotypes te analyseren.

The bloedafname wordt verricht door, voor bloedafname, gekwalificeerd personeel
van het Azm of de UM. Een enkele bloedafname van 10ml is een kleine invasieve
procedure waarbij geen nadelige gevolgen worden verwacht. Deelnemers hoeven
voorafgaand aan bloedafname niet nuchter te zijn. Deelnemers hebben geen
voordelen van deelname aan de studie. Wel verwachten we dat deze studie
bijdraagt aan nieuwe inzichten in de fractuur- en kraakbeengenezing, waardoor
patiënten in de toekomst mogelijk voordelen van deze studie ervaren.