Ontwikkeling van een in vitro keloid model voor het identificeren en testen van nieuwe therapieën voor littekens.

Keloidvorming is het resultaat van abnormale wondgenezing, waarin een
overmatige hoeveelheid littekenweefsel zich vormt dat buiten de begrenzingen
van de oorspronkelijke wond groeit. Momenteel zijn er nog geen adequate
behandelingen en recidief keloidvorming na een eerdere behandeling komt vaak
voor. Om betere therapieen te ontwikkelen, zijn superieure littekenmodellen
nodig om nieuwe therapeutica and combinaties van therapeutica te testen en om
nieuwe *drug targets* te identificeren. Aangezien keloiden niet voorkomen in
dieren, is de ontwikkeling van relevante humane in vitro modellen vereist.
Daarom hebben we een *tissue engineered* basis keloid model ontwikkeld aan de
hand van restmateriaal verkregen van ge-excideerde keloiden. Dit basis model
bestaat uit een gereconstrueerde epidermis op een met fibroblasten gepopuleerde
dermale matrix. Alhoewel dit basis model wel degelijk afwijkingen wijzend op
beginnende keloidvorming vertoonde, bleef een overtuigend keloid fenotype
afwezig. Recente literatuur doet vermoeden dat naast de intrinsieke afwijkingen
die gevonden zijn in keratinocyten en fibroblasten afkomstig van keloiden, een
immuun component (monocyten)essentieel is voor keloidvorming. Er is dus een
sterke indicatie voor het toevoegen van deze monocyten die afkomstig zijn van
keloid patiënten, aan het huidige basis model. Daarnaast verwachten we ook dat
de intrinsieke afwijkingen van het immuunsysteem in keloid patienten zich niet
zal beperken tot de monocyten alleen. We zullen daarom ook T-cellen en PBMC*s
(perifere bloed mononucleaire cellen) isoleren en toevoegen aan het basis
keloid model.

N.B. Onderstaand beschreven doelen en eindpunten refereren allemaal naar in
vitro testen. De enige patiënt interventie betreft het afnemen van perifeer
bloed om het materiaal te verkrijgen waarmee de in vitro testen zullen worden
uitgevoerd.

Primair doel:
de ontwikkeling van een humaan, in vitro, immunocompetent, full-thickness
tissue engineered keloid model en de identificatie van robuste en relevante
parameters waarmee de mate van keloidvorming in vitro kan worden bepaald. Het
keloid model zal worden vergeleken met het normale litteken model om deze
parameters te kunnen identificeren.
- In vitro keloid parameters: e.g. toegenomen epidermale en dermal dikte;
contractie, myofibroblasten (α-SMA expressie), cytokine/chemokine expressie
(ELISA).
- In vitro immuuncel parameters: e.g. veranderingen in monocyt en T-cell
fenotype na co-culture met keloid ten opzichte van normal weefsel. Flow
cytometric analysis om de overgang naar e.g. macrofagen, Th1, Th2, fibrocyten,
endotheelcellen etc. te bepalen.

Secundair doel:
de validatie van het in vitro model met bestaande therapeutica die momenteel
gebruikt worden in de littekenpoli van de afdeling Plastische Chirurgie (e.g.
5-FU, corticosteroiden kunnen dienen als positieve controles) en therapeutica
waarvan bekend is dat deze geen effect hebben op littekens (e.g. vitamine D3
kan dienen als negatieve controle). De therapeutica zullen worden toegepast op
de keloiden tijdens het kweken, waarna de aanwezigheid van de eerder
geïdentificeerde keloid parameters (geïdentificeerd voor het primaire
doeleinde) in de littekenmodellen worden geanalyseerd. We verwachten dat de
bestaande therapeutica de littekenparameters (deels) zullen normaliseren,
terwijl de negatieve controle therapeutica geen effect zullen hebben.

Perifeer bloed zal afgenomen worden van keloid patiënten tijdens een reguliere
behandelingsafspraak op de afdeling Plastische Chirurgie. Het bloed zal dan
naar het Dermatologie lab worden gebracht waar de immuuncellen (o.a. monocyten,
PBMCs, T-cellen) uit het bloed zullen worden geïsoleerd om in co-culture
gebracht te worden met de littekenmodellen. Parallel hieraan zal ook perifeer
bloed worden afgenomen van gezonde controles van wie bekend is dat ze normale
littekens vormen na trauma.

Huid equivalenten (modellen) van keloiden en normale littekens zullen worden
gemaakt met behulp van restmateriaal verkregen van standaard chirurgische
procedures. Deze zullen in co-culture gebracht worden met de immuuncellen (o.a.
monocyten, PBMCs, T-cellen) die uit het perifere bloed geïsoleerd zijn, in een
twee compartimentaal transwell systeem. Na afloop van de kweekperiode zullen de
littekenparameters worden geanalyseerd in de modellen.

De totale duur van het project wordt geschat op drie jaar (Agentschap NL heeft
het project reeds gefinancierd). Dit behelst de ontwikkeling van het in vitro
keloid model en de validatie daarvan met zowel bestaande therapeutica als
negatieve controle therapeutica. Elk onafhankelijk experiment zal vier
onafhankelijke series vereisen met elk verschillend donor materiaal, om
statistische analyses uit te kunnen voeren. Gedurende een periode van drie jaar
zal 140ml perifeer bloed afgenomen worden van maximaal n=30 keloid patiënten en
n=30 gezonde vrijwilligers om het immunocompetente humane in vitro keloid model
te kunnen ontwikkelen en valideren met bestaande therapeutica.

Patiënten die bekend zijn met keloidvorming na trauma zullen worden
geselecteerd en benaderd voor deelname aan de studie door de plastisch
chirurgen van de afdeling Plastische Chirurgie in het VUmc tijdens
poliklinische afspraken. Na verkrijging van hun toestemming, zal het perifere
bloed tijdens reguliere poliklinische afspraken worden afgenomen.

Gezonde controles die normale littekens vormen na trauma, zullen ook worden
geselecteerd en benaderd door dezelfde plastisch chirurgen en ook door
onderzoekers zelf (wanneer deze in contact komen met mensen die slechts normale
littekens vormen na een trauma).

De venapunctie zelf is geassocieerd met minimale risico's zoals nabloeding,
flauwvallen of licht gevoel in het hoofd, hematoomvorming, infectie (minimaal
risico bij elke doorbreking van de huidbarriere). Echter, venapunctie wordt op
zodanig grote schaal zonder noemenswaardige problemen toegepast voor
diagnostische doeleinden, dat er nog maar weinig mensen zijn die nooit eerder
venapunctie hebben ondergaan.
Daarnaast is er nog bij keloid patiënten een theoretisch, nog nooit eerder
beschreven risico op keloidvorming op de plaats van de venapunctie.
Alhoewel er geen direct voordeel is voor de patiëntengroep, kunnen de
uitkomsten van onze studie leiden tot de ontwikkeling van verbeterde
behandelingsmethoden voor keloid patiënten en zal op deze wijze zeker voordelig
kunnen zijn in de toekomst. Gezien de beperkingen van huidige behandelingen en
het onvermogen keloiden effectief te verwijderen, zijn keloid patiënten vaak
zeer bereid te participeren aan onderzoek, omdat ze zich realiseren dat zonder
onderzoek ook geen betere behandeling voor hun aandoening kan worden
gerealiseerd.