Monitoring van de "gezonde" immuunrespons in de schildwachtklier bij patienten die een profylactische mastectomie ondergaan.

Het mammacarcinoom is met een life-time risico van 12-13% een van de meest
voorkomende vormen van kanker bij vrouwen. Voor een adequate locoregionale
behandeling is een goede lymfeklierstadiering van de oksel met behulp van de
sentinel node procedure onmisbaar. Op basis van het typische lymfogene
metastaseringspatroon bij het mammacarcinoom is de sentinel node (SLN) de plek
waar als eerste eventuele metastasen kunnen worden aangetroffen. De sentinel
node is dus ook de eerste lymfeklier waar cellen van het immuunsysteem
potentieel in aanraking komen met tumorcellen en vormt om deze reden in
toenemende mate een populair focus voor tumor immunologisch onderzoek. Het
immuunsysteem kan een beschermende rol spelen in de ontwikkeling en
uitzaaiingen van tumoren. Soms is dit afweermechanisme niet voldoende en kan de
tumor zich verder verspreiden. Meerdere mechanismen spelen een rol in deze
zogenaamde *tumorescape'. Wat we uit onderzoek naar melanomen weten, is dat
deze immuunsuppressie het sterkst is in en rond de primaire tumor en in de
lymfeklieren die het dichts bij de tumor liggen, met name in de sentinel
node1,2. Er zijn aanwijzingen dat disfunctionele dendritische cellen en
immuunsuppressieve regulatoire T-cellen (T-regs) een grote rol in dit proces
spelen 3,4. Hoe deze immuunsuppressie bij het mammacarcinoom precies tot stand
komt en hoe dit op celniveau tot uitdrukking komt is nog relatief onbekend.

Om veranderingen in immuunrespons van SLN*s bij het mammacrcinoom zo nauwkeurig
mogelijk in kaart te brengen is het van groot belang om informatie te hebben
over de immuunstatus van SLN van gezonde patiënten. SLNs van vrouwen die in
preventieve setting een ablatio ondergaan vormen naar onze mening de meest
betrouwbare groep om een gezonde immuunrespons te meten welke als controle
meting kan dienen in verder onderzoek naar de immuunrespons in de sentinel node
van mammacarcinoom patiënten.

In het Nederlands Kanker Instituut- Antoni van Leeuwenhoek ziekenhuis worden
jaarlijks een groot aantal (20-25) preventieve mastectomieen verricht. Deze
grote potentiële onderzoekspopulatie maakt samenwerking tussen het NKI-AVL en
onze reeds bestaande onderzoeksgroep (Kennemer Gasthuis/ VUmc Cancer center
Amsterdam) op gebied van de immuunstatus naar de SLN bij het mammacarcinoom
uitermate geschikt voor het uitvoeren van immunologisch onderzoek naar de
immuunstatus in lymfeklieren van gezonde patiënten.

Naast het feit dat de sentinel node een populair focus is geworden voor tumor
immunologisch onderzoek, heeft het toegenomen gebruik van de sentinel node
procedure bij het mammacarcinoom geleid tot discussie over het bestaan van
fout-positiviteit. Een aantal studies beschrijft het fenomeen van iatrogene
verplaatsing van (benigne en/of maligne) epitheliale cellen naar de
lymfklieren, hetgeen gerelateerd zou zijn aan manipulatie van de mamma. Met
name de detectie van geïsoleerde tumor cellen door immuunhistochemisch
aankleuring op keratine zou hierdoor beïnvloed kunnen worden.
Vanuit dit oogpunt bieden lymfeklieren van gezonde patiënten die in preventieve
setting een mastectomie ondergaan (patiënten die dus geen borstkanker hebben
maar wel manipualtie van de mamma ondergaan) een unieke mogelijkheid om de
eerder beschreven iatrogene verplaatsing van epitheliale cellen te onderzoeken.

Lymfedrainagepatroon van de mamma en de sentinel node
Mammacarcinoom kan lymfogeen en hematogeen metastaseren. Het primaire lymfogene
metastaseringspatroon bij het mammacarcinoom is naar de oksel. Hoewel ook
bekend is dat metastasering ook naar extra-axillaire klieren kan plaatsvinden
(intra mammair, parasternaal, claviculair) en dat dit mogelijk kan leiden tot
betere stagering, heeft dit tot op heden nog geen consequenties in de standaard
behandeling van mammacarcinoom patiënten5. Voor het mammacarcinoom (T1-T2N0) is
het uitvoeren van een sentinel node procedure (SNP) de standaard methode voor
adequate lymfeklier stadiëring. De SNP is het betrouwbaarst als deze wordt
uitgevoerd volgens de triple methode (Pre-operatieve lymfoscintigrafie,
peroperatief inspuiten van Patent Blue en probe-geleide detectie van de SLN)6.
Resultaten van verschillende studies tonen dat in meer dan 95% van de patiënten
een SN gevonden kan worden en dat deze de aan- of afwezigheid van
okselkliermetastasen in 95% van de gevallen betrouwbaar voorspelt7-11.

Bij een preventieve mastectomie is een SLN procedure geen onderdeel van de
standaard operatieve procedure. Om additionele overlast voor de patiënten die
deelnemen aan deze studie te voorkomen, zullen zij geen lymfoscintigrafie
pre-operatief ondergaan. Voor de identificatie van de SLN zal Patent Blue
worden gebruikt. Om tatoeëring van de huis te voorkomen, zal Patent Blue
intraparechymateus worden gespoten.
Op basis van de veronderstelling en het feit dat ook bij gezonde mamma*s het
lymfedrainage patroon in de meeste gevallen naar de axilla is, denken we dat de
immuunstatus in de SLN van gezonde patiënten de meest betrouwbare controle
meting vormt voor verder immunologisch onderzoek bij het mammacarcinoom.

Immuunstatus van de SLN bij het mammacarcinoom
Het is bekend dat het immuunsysteem een beschermende rol kan spelen tegen het
ontwikkelen van een maligniteit. Dit gebeurt via dezelfde wegen als een gewone
immuunrespons; tumorinfiltrerende Dendritische Cellen (DC) nemen tumorantigenen
op. Deze antigenen worden in de Tumor Drainerende Lymfklieren (TDLK)
gepresenteerd aan CD4+ T-helper (Th) en aan CD8+ Cytotoxische T-Lymfocyten
(CTL). Die zijn vervolgens in staat een tumorspecifieke reactie te
bewerkstelligen. Echter, soms slaagt het immuunsysteem er niet in de cellen op
te ruimen of de tumor slaagt er in zich zo te ontwikkelen dat het immuunsysteem
niet meer in staat is de cellen te herkennen. Hierdoor ontstaat een situatie
waarin de tumor kan groeien en uit kan zaaien. Meerdere mechanismen spelen bij
deze zogenaamde *immuunescape* een rol: immuunsuppressieve factoren in het
milieu van de tumor, onvermogen van T-cellen om de tumor te penetreren, verlies
van expressie van co-stimulatoire moleculen op daar tumor geconditioneerde DC
waardoor T-cel anergie ontstaat, of onderdrukking van de immuunrespons door
regulatoire T-cellen (Treg).3

Verschillende studies hebben immunologische veranderingen beschreven in de SLN
van mammacarcinoom patiënten. Sommigen beschrijven de SLN in
borstkankerpatiënten als immuuncompetent, met verhoogde frequenties van
(mature) dendritische cellen vlak voor het metastaseringsproces.12-14 Anderen
beschrijven juist een downregulatie van de immuunrespons in de SLN vergeleken
met non-SLN, voorafgaand aan het proces van metastasering.15,16 Aanvullende
immunologische analyses zijn noodzakelijk om in kaart te brengen waar deze
immuunsuppressie het sterkst is en hoe deze functioneel tot uitdrukking komt in
de verschillende DC en T-cel subsets.

Naar ons weten zijn er tot op heden nog geen studies die de immuunstatus in
axillaire SLN van gezonde mensen in kaart hebben gebracht. Door middel van
deze studie willen we inzicht krijgen in hoe een normale immuunrespons in
axillaire klieren eruit ziet. In een andere, door onze onderzoeksgroep
geïnitieerde, studie die parallel loopt aan dit onderzoek zal functioneel
immunologisch onderzoek worden toegepast naar de immuunrespons in SLN*s van
mammacarcinoom patiënten.


Detectie van geïsoleerde tumorcellen
De klierstatus is een van de belangrijkste prognostische criteria bij het
mammacarcinoom. Zoals eerder beschreven is de sentinel node procedure is een
betrouwbare methode voor de initiële lymfeklierstadiering.
Sinds 2002 is het stageringssysteem voor borstkanker aangepast en worden
micrometastasen (een focus groter dan 0,2 mm en kleiner of gelijk aan 2 mm) en
geïsoleerde tumor cellen (solitaire cellen of celclusters kleiner dan 0,2 mm in
de randsinus) apart geclassificeerd naast macrometastasen.17
Wat betreft de klinische betekenis van micrometastasen in de SLN is bekend dat
in ongeveer tot 15% van de gevallen aanvullende kliermetastasen worden
gevonden. Verder zijn SLN micrometastasen geassocieerd met een slechtere
overleving18-20 Derhalve bestaat er in deze groep een indicatie voor een
aanvullend okselkliertoilet, en is adjuvante chemotherapie te overwegen.
Op het gebied van geïsoleerde tumorcellen is er in de literatuur nog veel
onduidelijkheid wat betreft de klinische en prognostische betekenis. Reed et al
en Cox et al21,22 vinden in hun series dat de aanwezigheid van isolated tumor
cells niet van invloed is op de ziektevrije overleving. De recent verschenen
MIRROR studie concludeerd echter dat micrometastasen in regionale lymfklieren
geassocieerd zijn met een significant slechtere 5-jaars ziektevrije overleving
bij patiënten met gunstige primaire tumorkenmerken die geen adjuvante
systemische therapie ondergingen. Een interessante bevinding was bovendien dat
het prognostische effect van geïsoleerde tumorcellen en micrometastasen
vergelijkbaar was.23 In de huidige Nederlandse richtlijn voor mammacarcinoom
vormen geïsoleerde tumorcellen in de SLN geen indicatie voor een aanvullend
okselkleirtoilet.

Pathologisch onderzoek van de sentinel node voor detectie van metastasen
bestaat uit haematoxyline/eosine (HE-) onderzoek van de sprongseries.
Uitgebreider onderzoek middels immuunhistochemie (IHC) kan eventuele
micrometastase en geïsoleerde tumorcellen detecteren, die bij HE-onderzoek niet
gevonden worden. Voor IHC bij het mammacarcinoom wordt standaard gebruik
gemaakt van antilichaam tegen keratine (CAM5.2 of AE1/AE3). Deze antilichamen
zijn echter niet specifiek voor mammacarcinoom maar binden aan epitheelcellen
in het algemeen.
Uit de literatuur is bekend dat SLN*s vals positief kunnen zijn wat betreft de
aanwezigheid van geïsoleerde tumorcellen (ITC). Sommige auteurs beargumenteren
dat het merendeel van de middels IHC aangetoonde ITC feitelijk geen echte
metastasen zijn. Zij suggereren dat gezonde epitheelcellen of tumorcellen
mechanisch verplaatst worden naar de SLN door pre-operatieve puncties of
per-operatieve manipulatie van mamma of tumor. Dit zogenoemde *benign
transport* zou verantwoordelijk zijn voor het vinden van (vals positieve)
*geïsoleerde tumor cellen* in de SLN.24-27 Daarnaast zijn er aanwijzingen dat
een deel van de geïsoleerde tumorcellen die gedetecteerd worden middels
histopathologisch onderzoek geen
maligne fenotype hebben en derhalve niet van klinische relevantie zijn omdat
deze niet kunnen uitgroeien tot locoregionaal recidief.28

Doordat we in deze studie lymfeklieren van borstkanker vrije patiënten middels
H&E en IHC onderzoek testen op het al dan niet positief aankleuren hopen we
meer duidelijkheid te verschaffen omtrent de significantie van het vinden van
geïsoleerde tumorcellen. Gezien het feit dat een gezonde mamma naar deze
lymfklieren draineert zouden er in principe geen aanwijzingen voor metastasen
of tumorcellen gevonden mogen worden in deze lymfklieren. Echter vind er wel
mammamanipulatie plaats door het uitvoeren van de mastectomie. Indien dus in
deze lymfeklieren celclusters of solitaire cellen positief aankleuren bij IHC
onderzoek en door de patholoog geduid worden als ITC, bevestigt deze bevinding
de hypothese dat iatrogene verplaatsing van benigne epitheliale cellen
verantwoordelijk is voor fout positieve uitkomsten.

Het primaire doel van deze studie is het ik kaart brengen van de immuunstatus
van axillaire lymfeklieren bij patiënten die in preventieve setting een
mastectomie ondergaan.
Secundair willen we onderzoeken of er middels het standaard
(immuun)histochemisch onderzoek, zoals gebruikt wordt voor detectie van
metastasen in SLN*s bij het mammacarcinoom, ook in deze lymfeklieren positieve
aankleuringen gevonden worden.

Van 20 vrouwen die in een preventieve setting een mastectomie ondergaan, wordt
tijdens dezelfde operatie de SLN verwijderd. Normaal gesproken wordt de SLN
geïdentificeerd door middel van de *triple-teckniek* bestaande uit
pre-operatieve lymfoscintigrafie, intratumorale of peri-aureolaire injectie van
Patent Blue, en gamma-probe-geleide verwijdering van de SLN. Echter, in deze
studie worden patiënten geincludeerd die een profylactische mastectomie zullen
ondergaan; zij ondergaan niet standaard een SLN procedure. Om additionele
overlast voor de patiënten te voorkomen, zullen zij geen lymfoscintigrafie
pre-operatief ondergaan. Voor de identificatie van de SLN zal alleen Patent
Blue worden gebruikt. Om tatoeëring van de huis te voorkomen, zal Patent Blue
intraparenchymateus worden gespoten.
Van deze lymfeklier zullen enerzijds viabele cellen verkregen worden voor
fenotypische en functionele immunologische analyses. Anderzijds zal de rest van
de lymfeklier gebruikt worden het standaard pathologisch onderzoek
(Hematoxyline & Eosine kleuring en Immuunhistochemie) voor detectie van
metastasen.

Patiënten ondergaan een additionele sentinel node procedure. Dit levert een
verlenging van de operatietijd op van ongeveer 15 minuten. Daarnaast zouden
deze patiënten een anafylactische reactie kunnen krijgen op het Patent Blue dat
wordt geïnjecteerd in het kader van de sentinel node procedure.