Het identificeren van nieuwe genen die epidermolysis bullosa veroorzaken m.b.v. exoom sequencing

Epidermolysis bullosa (EB) is een heterogene groep van erfelijke huidziekten
die gekenmerkt wordt door trauma geïnduceerde blaarvorming en erosies van de
huid en slijmvliezen vanaf de geboorte. Er zijn meer dan 25 verschillende
subtypes waarbij de ernst van de ziekte varieert. Op dit moment zijn er 18
genen beschreven waarin mutaties kunnen leiden tot EB. Overgeërfde mutaties in
één van de 18 genen resulteren in afwezigheid of vermindering van één van de
eiwitten die belangrijk zijn voor de aanhechting van de epidermis aan de
dermis. Het deficiënte eiwit, dat aangedaan is door de genetische mutatie,
bepaalt op welk niveau er blaarvorming optreedt in de huid: van in de epidermis
bij EB simplex tot onder de basaal membraan zone in de dermis bij dystrofische
EB.

Naast de klinische beoordeling bestaat de diagnostische evaluatie van een kind
geboren met EB uit moleculaire analyse van huidbiopten gebruikt voor
immuno-antigen mapping en elektronenmicroscopie, gevolgd door genetische
analyse. Deze methoden stellen ons in staat om het niveau van blaarvorming in
de huid te beoordelen, welk eiwit gereduceerd of abnormaal is aangemaakt, en
vervolgens welk subtype van EB de patiënt hoogstwaarschijnlijk heeft. In
Nederland worden bijna alle bekende EB genen diagnostisch getest. De mutatie
wordt echter niet altijd gevonden. Zo werd er in 17% van de patiënten verdacht
voor EB simplex geen mutatie gevonden. In de meeste gevallen worden de EB genen
één voor één getest wat ertoe leidt dat het lang duurt en dat er hoge kosten
mee gemoeid zijn.

Het bepalen van de (genetische) diagnose bij een kind met EB is belangrijk
aangezien het waardevolle informatie oplevert t.a.v. de etiologie, prognose,
mogelijk geassocieerde aandoeningen en herhalingsrisico. De identificatie van
een bepaalde (genetische) diagnose is ook belangrijk voor gezinsplanning en
reproductieve keuzes, en mogelijk prenatale diagnostiek of pre-implantatie
genetische diagnostiek (PGD).

In Nederland worden er ongeveer 20 baby*s per jaar geboren met EB. Er bestaat
een behoefte aan een snelle en brede aanpak om het diagnostische proces te
versnellen en te vereenvoudigen met als doel de diagnostische opbrengst te
verhogen, en ook andere nog niet bekende EB genen te identificeren. Vanwege
deze redenen willen we de toegevoegde waarde bepalen van exoom sequencing in de
diagnostische evaluatie van patiënten met EB.

Door gebruik te maken van exoom sequencing kunnen alle exonen van alle bekende
genen van een individu geanalyseerd worden met één test. Deze techniek maakt
het dus mogelijk om parallel een analyse te doen van alle bekende EB genen. Dit
kan bereikt worden door het oppikken van alle bekende genen die gerelateerd
zijn aan EB, en vervolgens sequencen van deze genen (= gerichte exoom
sequencing). Als een alternatief kunnen alle genen worden opgepikt en
gesequenced, en vervolgens kan een filter voor EB tijdens het data-analyse
proces worden toegepast (= exoom sequencing met gerichte analyse). De laatste
aanpak maakt het ook mogelijk om nieuwe genen die betrokken zijn bij EB te
identificeren, omdat de sequence data van alle andere genen beschikbaar blijft.
Bovendien kan het data-analyse proces eenvoudig worden bijgewerkt zodra nieuwe
informatie over een ander gen dat betrokken is bij EB beschikbaar komt.
De afdelingen Genetica & Dermatologie werken momenteel samen aan het opzetten
van een huidpanel met next generation sequencing. Dit panel zal alle bekende EB
genen includeren zodat elke nieuwe patiënt gescreened kan worden op mutaties in
deze bekende genen. *Whole exome sequencing* zal aan dit huidpanel nieuwe genen
toevoegen wanneer deze geïdentificeerd worden.

Exoom sequencing heeft een aanzienlijk hoger percentage van vals negatieve of
vals positieve bevindingen in vergelijking met de klassieke Sanger sequencing.
De dekking varieert tussen exonen, en het kan voorkomen dat sommige exonen in
het geheel niet worden opgepikt. Dit is in het bijzonder het geval voor *whole
exome sequencing*. Het grootste voordeel is echter dat exoom sequencing het
mogelijk maakt om alle EB genen tegelijkertijd te analyseren met één test. Onze
verwachting is daardoor dat de diagnostische opbrengt veel hoger is dan met de
tot nu toe gebruikte strategie van sequentiële en gerichte genetische analyse.

Door deze methode te gebruiken als een standaard genetische diagnostische tool
voor EB verwachten we een kortere tijdsduur en reductie in de kosten. Een
vergelijkbare studie met niet-gerichte exome sequencing in ons centrum liet
zien dat exome sequencing pathogene mutaties kan identificeren in reeds bekende
en nieuwe genen bij patiënten met microcefalie, een aandoening die bekend staat
om zijn heterogeniteit. Bij een aanzienlijk aantal patiënten, van wie de meeste
al meerdere jaren hadden gewacht op de diagnose, kon de genetische diagnose
vastgesteld worden.

McGrath et al. heeft recent gebruik gemaakt van *genome wide whole exome
sequencing* in een familie die klinisch was gediagnosticeerd als EBS. Er werd
een homozygote frameshift mutatie gevonden in drie individuen met een atypisch
fenotype. Hun bevinding zorgde ervoor dat gevonden werd dat het Slab2b effector
eiwit belangrijk is voor de hechting van de huid. Hun resultaten konden
bevestigd worden door immuno-antigen mapping en electronenmicroscopie. McGrath
et al. identificeerde niet alleen een nieuw gen, exophilin 5, dat betrokken is
bij EB, maar ze konden ook deze grote familie genetisch counselen. Deze studie
bevestigt dat exoom sequencen een waardevol instrument is bij het vinden van
nieuwe EB genen.

Een grote zorg voor zowel de dermatologie clinici en de klinische genetici is
dat er een kans bestaat dat relevante mutaties worden gevonden die niet EB
gerelateerd zijn gedurende exoom sequencing.
De belangrijkste focus van deze studie is om nieuwe ziektegenen te vinden en
hun fenotypische betekenis te correleren (zie primaire en secundaire
eindpunten). De kans dat varianten in genen die niet gerelateerd zijn aan EB
worden gevonden bestaat, maar is erg klein. Veel technieken en strategieën
worden uitgevoerd om de kans daarop verlagen waaronder:

• Linkage analyse voorafgaand aan of als eerste stap na het exoom sequencing in
families met meerdere aangedane individuen kan al wijzen naar één of meerdere
genetische regio*s van belang. De varianten in de genen in deze regio(*s)
gevonden met behulp van exoom sequencing zullen worden geprioriteerd voor
verdere analyse. Deze prioritering zal gemaakt worden op basis van de functie
en de lokalisatie van de eiwitexpressie, en zal vervolgens bevestigd dienen te
worden met Sanger sequencing.

• Trio-analyse van de exome sequencing data zal worden toegepast in gezinnen
met slechts één aangedaan individu. Bij trio analyse worden de varianten die in
de proband zijn gevonden gefilterd tegen de varianten in de gezonde ouders. Op
die manier worden de varianten die overgeërfd zijn van de ouders in het
getroffen kind eruit gefilterd. Dit resulteert in een selectie van de novo
varianten in het kind. De resterende varianten, meestal 1-6 varianten met deze
strategie worden verder geselecteerd op basis van hun genfunctie. Genen met
betrekking tot de huid of genen die tot eiwitexpressie in de huid en
slijmvliezen resulteren worden verder onderzocht.

Zowel linkage analyse als Trio analyse richten zich op de meest waarschijnlijke
ziekteverwekkende locus binnen elke onderzochte EB familie en verminderen de
kans op het vinden van mutaties in niet-EB gerelateerde ziektegenen.

De toegevoegde waarde bepalen van het gebruik van exoom sequencing in de
diagnostische evaluatie van patiënten met epidermolysis bullosa.

Observationeel onderzoek met invasieve meeting.

De lasten en risico's verbonden aan deelname zijn te verwaarlozen. Ons
onderzoek is een uitbreiding van de reguliere diagnostische zorg die patiënten
hebben gekregen. Een bloedmonster zal worden genomen wanneer onvoldoende DNA is
beschikbaar.
Als een pathogene mutatie wordt gevonden, worden de patiënt en de familie
begeleid door de dermatoloog en een ervaren klinisch geneticus. In het
onwaarschijnlijke geval, maar vooralsnog niet uitgesloten kans dat een
ongevraagde bevinding zich voordoet, zal de familie worden begeleid door een
klinisch geneticus met relevante ervaring en na inter-collegiale overleg. Dit
inter-collegiale overleg is onderdeel van de routinematige procedures binnen de
afdeling Genetica.

De identificatie van de genetische mutatie biedt de patiënt en familie vele
voordelen. Wanneer een aangedaan individu geïnformeerd kan worden over
zijn/haar ziekte is dit nuttig in vele opzichten:
- het zou het omgaan met deze ernstige ziekte kunnen verbeteren
- het resulteert in betere informatie over de prognose.
- het kan het aantal andere toekomstige diagnostische evaluaties verminderen
- het kan voordelen voor de familie bieden door verbeterde genetische
counseling, hulp bij de besluitvorming met betrekking tot gezinsplanning,
dragerschap testen in familieleden en mogelijk het aanbieden van prenatale
diagnostiek.